Banyak bakteri yang diketahui dapat menginfeksi serangga namun selama ini hanya dua genus yang telah digunakan secara komersial untuk mengendalikan serangan hama. Yaitu Bacillus dan Serratia. Salah satu spesies, yaitu Bacillus thuringiensis (sering disingkat Bt), adalah bakteri yang berhasil digunakan secara luas sebagai insektisida mikrobia. Sebagai contoh B. thuringiensis subsp. Kurstaki telah digunakan secara luas untuk mengendalikan serangga Lepidoptera. Bacillus thuringiensis sampai sekarang sudah terdaftar lebih dari seratus produk B. thuringiensis subsp. Kurstaki (sering disingkat Bt.k). selain subsp. Kurstaki, beberapa subsp. Lain juga telah dikembangkan sebagai insektisida mikrobia, misalnya B. thuringiensis subsp. Aizawai yang digunakan untuk mengendalikan serangga Lepidoptera lain yang tidak rentan terhadap Bt.k.
B. thuringiensis adalah bakteri aerob yang tersebar di banyak habitat tanah, membentuk spora dan menghasilkan toksin yang dapat membunuh serangga target, yaitu toksin-α, toksin-β, eksotoksin-δ dan endotoksin-δ. Toksin-toksin tersebut diperoleh dalam bentuk kristal. Toksin B. thuringiensis dikode oleh gen cry yang ada pada plasmid di dalam sel bakteri tersebut. Toksin yang dihasilkan oleh B. thuringiensis berupa kristal parasporal yang masih berupa prototoksin protoksin yang belum aktif. Pada waktu toksin tersebut dimakan oleh serangga yang rentan, maka protoksin tersebut akan terlarut dalam system pencernaan serangga yang bereaksi alkaline dan mengalami pemrosesan oleh enzim protease yang ada di dalam pencernaan serangga. Toksin yang sudah diaktifkan akan menembus matriks peritrophik dan menempel pada suatu reseptor yang sangat spesifik. Toksin tersebut kemudian menginduksi pembentukan pori-pori litik pada membran epitel. Pembentukan pori-pori tersebut menyebabkan terjadinya ketidakseimbangan konsentrasi ion sehingga terjadi lisis sel. Pengurangan makan oleh larva dan akhirnya terjadi kematian larva. Sisa-sisa tubuh serangga yang mati tersebut dapat digunakan sebagai substrat untuk pertumbuhan B. thuringiensis dari sporanya. Bakteri yang tumbuh kemudian membentuk spora lagi dan melepaskannya kea lam/tanah sehingga dapat mengulangi siklus pertumbuhannya. Strain B. thuringiensis yang berbeda mempunyai plasmid yang mengandung gen toksin yang berbeda toksin yang dihasilkan oleh strain berbeda diklasifikasikan menggunakan notasi Cry (crystal toxin), misalnya Cry1, Cry2,
Pada tanaman trangenik padi, sifat padi yang direkayasa adalah ketahanan terhadap hama penggerek batang dengan cara mengintroduksikan gen cry dengan cara aplikasi teknologi DNA dan mengekspresikannya dalam jaringan tanaman, meskipun sampai saat ini belum ada varietas padi Bt yang siap dijual kepada petani, namun melalui teknologi DNA, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, telah berhasil menginsersikan gen cry1Ab yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis ke dalam genom padi cv. Rojolele. Gen ini menghasilkan kristal protein yang bersifat toksik terhadap Lepidoptera, namun tidak berbahaya bagi manusia.
2. Pembuatan Tanaman Transgenik pada Padi yang Tahan Terhadap Serangan Hama.
a. Isolasi
Untuk membuat tanaman transgenik padi yang tahan terhadap hama, pertama-tama dilakukan identifikasi atau pencarian gen cry 1Ab yang akan menghasilkan kristal protein yang bersifat toksik terhadap Lepidoptera. Gen ini berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis. Untuk menyisipkan gen cry 1Ab pada sel tanaman padi, maka terlebih dahulu harus dilakukan isolasi DNA yang mencakup gen tersebut. Caranya yaitu dengan pemecahan sel menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel dengan dikombinasikan dengan pemanasan terlebih dahulu sehingga sel lebih mudah untuk pecah. Setelah itu dilakukan pemurnian DNA genom dan kemudian dilakukan pemotongan DNA.
b. Pemotongan DNA
Pemotongan DNA genom B. Thuringiensis dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi, yang sering digunakan adalah tipe II (enzim EcoRi) karena urutan nukleotida yang dikenali dan dipotong oleh enzim tersebut adalah sama sehingga memudahkan kloningnya.
c. Penyambungan DNA ke Dalam Vektor Plasmid Ti.
Molekul-molekul DNA yang mempunyai ujung hasil pemotongan yang sama dapat disambung dengan menggunakan enzim DNA ligase. Potongan DNA genom B. Thuringiensis kemudian disambungkan dengan potongan Plasmid Ti dalam sel Agrobacterium tumefaciens yang dapat digunakan untuk menyisipkan gen cry 1Ab ke dalam genom tanaman karena ada fragmen T-DNA yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman pada waktu Agrobacterium tumefaciens menginfeksi sel tanaman. Gen cry 1Ab yang disisipkan pada daerah retriksi selanjutnya dapat diperbanyak di dalam sel Escheria coli sebagai inang sementara. Vektor rekombinan yang membawa gen cry 1Ab kemudian dimasukkan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens yang membawa plasmid Ti alami. Kemudian kedua plasmid tersebut berekombinasi homolog dan menyebabkan plasmid alami terintegrasi.
d. Trnsformasi
1. Metode senjata gen atau penembakan mikro-proyektil.
Metode ini sering digunakan pada spesies jagung dan padi. Untuk melakukannya, digunakan senjata yang dapat menembakkan mikro-proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman. Mikro-proyektil tersebut akan mengantarkan gen cry 1Ab untuk masuk ke dalam sel tanaman padi. Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel selama penembakan berlangsung.
2. Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens.
Metode Agrobacterium melibatkan penggunaan bakteri tanah dikenal sebagai Agrobacterium tumefaciens yang memiliki kemampuan untuk menginfeksi sel-sel tumbuhan dengan sepotong DNA-nya Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen cry 1Ab yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Potongan DNA yang menginfeksi tanaman terintegrasi ke dalam kromosom tanaman melalui tumor-inducing plasmid (Ti plasmid) yang dapat mengontrol system selular tanaman dan menggunakannya untuk membuat banyak salinan DNA bakterinya sendiri. Ti plasmid adalah partikel DNA besar berbentuk lingkaran yang mereplikasi secara independen dari kromosom bakteri. Dengan cara demikian maka gen cry 1Ab akan terintegrasi dengan genom tanaman dan tetap setabil melalui pembelahan mitosis / meiosis sel tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.
Sel Agrobacterium tumefaciens yang sudah membawa gen cry selanjutnya ditumbuhkan bersama-sama dengan jaringan tanaman yang akan ditransformasi (teknik ko-kultivasi) jaringan tanaman yang akan di ko-kultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens dapat diambil dari irisan daun (leaf disc). Jaringan tersebut kemudian dicelupkan sebentar ke dalam kultur Agrobacterium tumefaciens selama semalam, selanjutnya diletakkan pada kertas filter steril dan akhirnya diletakkan pada medium non-selektif untuk proses ko-kultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens selama 2-3 hari. Medium yang digunakan tersebut juga mengandung antibiotik yang sesuai sehingga jaringan tanaman yang di transformasi tetap dapat tumbuh. Setelah proses transfer DNA selesai, dilakukan seleksi sel daun untuk mendapatkan sel yang berhasil disisipi gen cry 1Ab. Hasil seleksi ditumbuhkan menjadi kalus (sekumpulan sel yang belum terdiferensiasi) hingga nantinya terbentuk akar dan tunas. Apabila telah terbentuk tanaman muda (plantlet), maka dapat dilakukan pemindahan ke tanah untuk menumbuhkannya. Untuk menganalisis keberhasilan transformasi tanaman maka dilakukan pengujian dengan menggunakan teknik DNA blotting, PCR.
e. Analisis dan Pengujian Keberadaan gen cry1Ab
• Amplifikasi DNA dengan teknik PCR
Penyisipan fragmen gen cry 1Ab di dalam vektor dapat di analisis dengan melakukan amplifikasi DNA dengan teknik PCR (Polimerase Chain Reaction). Primer yang digunakan dapat berupa oligonukleotida yang komplementer fragmen gen cry 1Ab tersebut, atau oligonukleotida yang komplementer dengan bagian hulu dan hilir tempat penyisipan fragmen gen cry 1Ab tersebut. . Hasil amplifikasi selanjutnya dianalisis dengan elektroforensis menggunakan gel agarose untuk membuktikan apakah ada pita DNA yang dapat teramplifikasi.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415161718 1920 2122 23 24 2526 2728 29 30 31 3233 34 35 36 37 38 39
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
• Uji imunokimia
Protein insekisida yang berasal dari B. Thuringiensis adalah protein-protein yang bukan enzim sehingga ekspresi protein-protein asing semacam ini pada tanaman transgenik tidak dapat dilakukan dengan menganalisis aktivitas enzimatiknya. Untuk itu dilakukan pengujian dengan metode imunokimia yang menggunakan antibodi terhadap protein tersebut. Antibodi yang dibuat terhadap protein semacam itu selanjutnya digunakan dalam teknik uji imunokimia, misalnya dengan tekinik ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) atau teknik imunoblotting.
Dengan teknik imunoblotting., protein-protein yang diekspresikan pada suatu jaringan tanaman, pertama kali harus di elektroforesis pada suatu gel. Kemudian dipindahkan (blotting) pada suatu membran khusus, misalnya nitroselulosa atau nilon. protein-protein yang menempel pada membran dengan (antigen) yang menjadi target analisis antibodi yang menempel pada protein target tersebut kemudian direaksikan dengan antibodi kedua yang dikonjugasi dengan enzim peroksidase. Selanjutnya ke dalam hasil reaksi antigen-antibodi tersebut ditambahkan senyawa kromogenik yang dapat menghasilkan perubahan warna. Hasil reaksi antigen-antibodi dideteksi secara langsung pada membran berupa pita berwarna.
1 2 3 4 5 6 7 8
